4篇《自然医学》论文或存重大纰漏，多名专家再质疑｜李红良涉嫌造假续之4
编者按
2018年初，李红良涉嫌造假问题浮现后，本刊连续跟踪报道，有读者提醒其发表在《自然医学》的四篇论文可能还有违反腺相关病毒实验研究常规方面的问题。目前，已有多位AAV基因治疗领域专家向《自然医学》提出质疑。《知识分子》在此提供相关专家意见，以便读者判断——是否因为李红良专业知识缺乏，造成了相关猴子实验可能存在重大纰漏？如果是，相关论文结果该作何解释？同领域专家一看而知的问题，如果李红良课题组也清楚，那么就进一步提出相关文章可能涉嫌造假。
撰文 | 叶无言
责编 | 李晓明
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“猴子有AAV8病毒抗体，AAV8不能用于猴子的基因表达；食蟹猴是野生猴，用于代谢研究背景差异太大，不可能得出文章中那么好的结果。以上问题已有几位教授向期刊质疑。” （舒心梨）
“遇到一个做AAV的资深专家，谈到这个研究，说大多数猴子（大约九成）因为饲养过程中的感染，血清内都有抗AAV的抗体，所以大多数猴子注射AAV之前都需要检测，否则完全不会发挥功能。”（周家喜）
在本刊登出一系列有关李红良《自然医学》论文涉嫌造假的报道后，有几位读者留言，提示本刊其猴子实验可能存在重大纰漏。这些意见认为，因为食蟹猴普遍存在抗AAV的抗体，所以在进行如论文所说的基因治疗之前应对猴子进行筛查。
本刊向AAV基因治疗领域的两位国际专家求证（两位专家分别为：Lili Wang, 宾夕法尼亚大学医学研究副教授；Haiyan Fu，美国哥伦布市全国儿童医院研究所基因治疗中心PI。相关问答请参阅文末）。综合两位专家的意见，她们一致认为，在这个案例中，在猴子实验之前，因为AAV在非人灵长类中广泛存在，应预先筛查猴子体内是否存在AAV8中和抗体，只有AAV8中和抗体阴性的动物才可用于实验。
从2017年至2018年发表的4篇《自然医学》论文（见文末附录之2、3、4、5）来看，李红良课题组没有提到曾对实验猴进行过筛选，看是否有抗AAV8的抗体；此外，从本刊获得的甲乙双方签订的50只猴子的购销合同看，李红良签字代表的甲方并没有委托乙方（广西防城港常春生物技术有限公司）进行过任何AAV抗体的筛查；从此前举报人霍文哲提供的来自李红良课题组的50只猴的“实验猴个体档案”看，也未列出任何AAV抗体的筛查项目和数据。
此外，两位专家对于李红良课题组在猴子实验7周之后于2016年5月6日进行的AAV8-CFLAR（S1）周围静脉注射，“以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达” 这一做法感到不可理解。
如果确实如李红良课题组回应的，在2016年3月17日至26日进行了50只猴子的肝脏门静脉AAV8注射，隔了不到两个月的5月6日再次进行AAV8-CFLAR（S1）注射，两位专家认为，因为第一次注射所产生的抗体，是不能达到所谓的增强表达的效果的。
有没有做筛查？又为何要做这样一个“无意义”的实验？这些关键的实验环节在论文中没有体现。
一个可能的情形是，李红良课题组不了解上述关键问题，其实验设计存在重大纰漏。那么接下来的问题是，论文中声称的AAV8介导的基因是如何成功表达并发挥了显著的治疗效果？
据可靠信源，目前国际上已有多位AAV基因治疗领域的专家向《自然医学》提出质疑。
两位专家答《知识分子》问
Lili Wang
Research Associate Professor of Medicine，Gene Therapy Program, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Division of Transfusion Medicine, University of Pennsylvania
问：李红良相关论文中的实验用猴是从广西一个猴场购买后适应了2周，论文没有显示有进行过AAV8抗体检测。利用非人灵长类动物如猴子做以AAV8载体的基因治疗前，是否必须先检测猴子是否感染过AAV8（体内有抗AAV8的抗体）或其它AAV型？
答：文章中没有表达转基因或肽的AAV构建体的相关描述，比如，用了什么启动子？文章中没有他们用于生产，纯化和滴定AAV8载体方法的有关描述。文章中没有提及他们在任何小鼠或猴子实验中使用的AAV8载体剂量。 没有这些信息，任何人都难以重复这些数据。
AAV8在猴子中非常流行，尽管不同群落之间的流行程度可能不同。 AAV预先存在的中和抗体（NAbs）可能影响AAV静脉递送（I.V.）的结果。 因此，对于静脉递送实验，我们总是预先筛选动物，看是否有预先存在的中和抗体，并且对于大多数实验，我们仅选择没有这些抗体的动物（除非是研究预先存在的中和抗体对转基因的影响）。 这两篇论文都没有提到这一点。（编者注：此处两篇论文系附录中受到质疑的李红良论文之4、之5，也即文首报道一中的C文和T文）
问：猴体内的抗AAV8的抗体会影响AAV8载体进入靶细胞，表达其所携带的基因么？这种影响和注射途径和部位有关么（如周围静脉或肝脏门静脉）？
答：在AAV领域众所周知，由于第一次载体注射产生的中和抗体，给已经有免疫活性的动物通过静脉递送相同血清型的AAV载体，这样的重新给药将不起作用。 这个小组在2017年10月的Nat Med（《自然医学》）上发表了一份勘误（参见本文附录李红良受质疑论文之1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28985205），他们说在方法部分漏掉了信息，在猴实验中，他们第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周后，还做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达。 不知道他们在第二次注射CFLAR（S1）后的表达是不是增加了，可（原则上）这是不可能出现的。
问：即使在没有抗AAV8抗体的情况下，AAV8载体所携带基因的表达有个体差异么？如果有，差异大么？
答：是的，即使没有AAV中和抗体，通常，在基因表达水平上，猴子之间也存在差异。 大型动物的差异通常要大于小鼠这样的（小型动物）。
Haiyan Fu
Principal Investigator，Center for Gene Therapy, Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, Columbus
问：文中的猴子是从广西一个猴场购买后适应了2周，论文没有显示有进行过AAV8抗体检测。利用非人灵长类动物如猴子做以AAV8载体的基因治疗前，是否必须先检测猴子是否感染过AAV8（体内有抗AAV8的抗体）或其它AAV型？
答：在非人灵长类使用AAV8进行基因治疗：已知AAV在非人灵长类中广泛存在，因此抗AAV很常见。因此，一般来说，在获得动物之前，应该进行筛查血清中是否存在相应AAV血清型的抗体，在这个案例中，应该筛查猴子中是否存在AAV8的抗体。通常，只有AAV8中和抗体阴性的动物才可用于实验, 除非实验的目的是调查抗AAV抗体对基因治疗影响。
问：猴体内的抗AAV8的抗体会影响AAV8载体进入靶细胞，表达其所携带的基因么？这种影响和注射途径和部位有关么（如周围静脉或肝脏门静脉）？
答：基于血清里抗体的水平多少，已经存在AAV8抗体的确会影响AAV8介导的基因递送的转导效率。已经存在的AAV抗体对静脉（常规周围静脉或通过门静脉）递送的AAV载体的肝脏转导的影响最大。
问： 该研究组在猴实验中，在第一次注射 AAV8-CFLAR(S1) 7周后，还做了第二次AAV8-CFLAR（S1 ）注射，以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达。 一些专家认为，这根本不起作用，不知道为何这样做，你如何评论？
答：关于该研究组所描述的重新给药，我同意其他专家的意见，没什么意义，因为在第一次注射之后，都会产生很高水平的抗体，因此第二次注射的载体都会被这些抗体清除掉。
问：即使在没有抗AAV8抗体的情况下，AAV8载体所携带基因的表达有个体差异么？如果有，差异大么？
答：一般来说，不管哪种AAV血清型，在AAV抗体阴性的动物（包括非人灵长类）中，AAV基因递送转导效率都存在个体差异。
附录：受到质疑的李红良《自然医学》论文
1. Wang, P.X., et al. Corrigendum: Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 1241 (2017).
2. Ji, Y.X., et al. The deubiquitinating enzyme cylindromatosis mitigates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine (2018).
3. Zhang, P., et al. The deubiquitinating enzyme TNFAIP3 mediates inactivation of hepatic ASK1 and ameliorates nonalcoholic steatohepatitis. Nature medicine 24, 84-94 (2018).
4. Wang, P.X., et al. Targeting CASP8 and FADD-like apoptosis regulator ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in mice and nonhuman primates. Nature medicine 23, 439-449 (2017).
5. Zhao, G.N., et al. Tmbim1 is a multivesicular body regulator that protects against non-alcoholic
fatty liver disease in mice and monkeys by targeting the lysosomal degradation of Tlr4. Nature medicine 23, 742-752 (2017).
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